Синтез пептидов
Эта статья предоставляет неспециалистам стратегические соображения и общую информацию о принципах пептидной химии. Она не является энциклопедической, а скорее посвящена истории и основам синтеза пептидов.
Краткая история синтеза пептидов
«Синтез пептидов» охватывает широкий спектр методов и процедур, позволяющих получать материалы — от малых пептидов до крупных белков. Работа Брюса Меррифилда, предложившего метод твёрдофазного синтеза пептидов (SPPS), радикально изменила стратегию их получения и упростила трудоёмкие и сложные этапы очистки, характерные для синтеза в растворе. Более того, метод SPPS открыл путь к автоматизации и разработке широкого спектра роботизированных систем. После задания стратегии синтеза и программирования аминокислотной последовательности машины могут автоматически выполнять все этапы синтеза и готовить сразу несколько образцов пептидов. Сегодня SPPS является основным методом получения пептидов, хотя синтез в растворе до сих пор используется для крупномасштабного производства некоторых пептидов.
Пептидная химия — это подраздел химии, который развивался с заметным опозданием. Её рост несопоставим с бурным развитием химии ароматических соединений, начавшимся с выделения бензола из каменноугольного газа Фарадеем в 1825 году и предложением его структуры Кекуле в 1865 году. Эти открытия стали основой производства красителей и лекарств, а затем и нефтехимии. Предыстория пептидной химии скрыта в ранних исследованиях белков и физиологической химии, например, в изучении связи между питательными веществами и составом крови.
Первый синтез пептида, а также сам термин «пептид» были описаны Германом Эмилем Фишером и Эрнестом Фурно в 1901 году. Они сообщили о получении первого дипептида, глицилглицина, путём частичного гидролиза HCl-глициндикетопиперазина.
На заседании Немецкого общества учёных и врачей в Карлсбаде в 1902 году Эмиль Фишер подвёл итоги изоляции аминокислот и пептидов из гидролизатов белков и обсудил соединение аминокислот в белках. В его собственных словах (перевод с немецкого): «идея, что амидные группы играют ключевую роль, напрашивается сама собой, как предполагал Хофмейстер в своей лекции сегодня утром». Фишер начал эксперименты по соединению аминокислот методами органической химии уже в 1900 году. Эти две лекции стали точкой отсчёта теории структуры белков Фишера-Хофмейстера. В своей лекции Фишер, совместно с Фурно описавший первый прототип — глицилглицин, также предложил термины «пептид, дипептид, трипептид» и позже — «полипептиды».
Эмиль Фишер и его сотрудники синтезировали около 100 пептидов в течение первого десятилетия XX века, используя методы, разработанные в его лаборатории. Эти пептиды содержали от 2 до 18 остатков аминокислот.
Работы по синтезу пептидов были продолжены Бергманом по традиции школы Фишера, систематически — совместно с Джозефом С. Фрутоном, присоединившимся к нему в 1934 году вскоре после приезда в Рокфеллеровский институт. Фрутон использовал возможности нового метода карбобензоксильной защиты для синтеза недоступных ранее пептидов, пригодных для изучения ферментативного гидролиза. Он и Бергман опубликовали синтезы простых субстратов, расщепляемых папаином, химотрипсином, трипсином и пепсином по определённым пептидным связям.
История пептидной химии охватывает более века — от простейших соединений, таких как диглицин, до ферментов, содержащих более сотни аминокислот. Благодаря индивидуальным свойствам каждой аминокислоты и разнообразию их комбинаций, пептиды обладают чрезвычайно широким спектром специфических функций. Они могут выступать в роли химических посредников, гормонов, внутриклеточных и межклеточных медиаторов, высокоспецифичных стимуляторов и ингибиторов, а также как биологически активные вещества в мозге и нервной системе. Многие антибиотики, полученные от бактерий, плесени и кожи земноводных, имеют пептидную природу, как и соединения, токсичные не только для патогенов, но и для клеток высших организмов. Пептиды, активно участвующие в иммунных реакциях, вызывают всё больший интерес у биомедицинских исследователей. Пептидная наука продолжает активно развиваться.
Защитные группы при синтезе пептидов
Поскольку аминокислота содержит кислотную группу на одном конце и основную — на другом, при отсутствии защиты легко происходит их полимеризация. Чтобы предотвратить это, применяются защитные группы.
В настоящее время при твёрдофазном синтезе пептидов наиболее широко используются две защитные группы — Fmoc (9-фторенилметилкарбамат) и t-Boc (ди-трет-бутилдикарбонат).
Защитная группа Fmoc
Использование Fmoc-химии для защиты альфа-аминогруппы стало предпочтительным методом в большинстве современных процессов синтеза пептидов как в растворе, так и на твёрдой фазе. Также было показано, что Fmoc-химия более надёжна и обеспечивает более высокое качество пептидов по сравнению с Boc-химией.
Преимущество Fmoc состоит в том, что она удаляется при очень мягких щелочных условиях (например, пиперидином), но остаётся стабильной в кислой среде. После обработки основанием незавершённый пептид промывается, затем добавляется смесь с активированной аминокислотой и реагентами для связывания, чтобы присоединить следующий остаток. После этого несвязанные реагенты удаляются промывкой, а защитная группа на N-конце удаляется, что позволяет добавить следующую аминокислоту или пептидный фрагмент тем же способом.
Бок-защитная группа
До того как Fmoc-группа стала популярной, t-Boc-группа широко применялась для защиты аминогруппы пептида на терминальном участке, что требовало использования более кислотостойких групп для защиты боковых цепей в ортогональных стратегиях. Boc-группы могут быть добавлены к аминокислотам с использованием ди-трет-бутилдикарбоната (ангидрида Boc) и подходящего основания.
t-Boc-защитная группа удаляется путём обработки защищённого остатка на цепочке сильной кислотой. Типичными реагентами для удаления в существующих методах являются трифторацетатная кислота (TFA) в дихлорметане, соляная кислота или метансульфоновая кислота в диоксане. Кислоту, используемую для удаления Boc-группы, обычно нейтрализуют третичным амином, таким как N-метилморфолин, N-диизопропилэтилами́н (DIEA) или триэтиламин (TEA).
Основные принципы и реагенты в пептидном синтезе
Образование пептидной связи требует активации карбоксильной группы аминокислоты,
где X — это галоген, C(O)R или другой электронноакцепторный атом или группа. Реакционноспособные производные карбоновых кислот, ацилхлориды или кислотные ангидриды были известны и использовались для получения амидов ещё до появления пептидной химии, но требовали защиты аминогрупп и карбоксильных групп.
Защитные группы (Y) не предназначались быть частью амидов и долгое время оставались проблемой. Первые производные пептидов, полученные синтетическим путём — бензоилглицилглицин и этоксикарбонилглицилглицин этиловый эфир — содержали блокирующие группы, которые невозможно было удалить без разрушения вновь образованной пептидной связи. Стало очевидно, что для пептидного синтеза требуются легко удаляемые защитные группы. Прорывом стало открытие бензилоксикарбонильной группы (карбобензоксигруппы, Z или Cbz) — выдающийся вклад Бергмана и Зерваса в 1932 году.
Бензилоксикарбонильную группу можно удалить с помощью каталитического гидрогенолиза при комнатной температуре и обычном давлении — процесс, который не затрагивает пептидные связи и функции боковых цепей и образует безвредные побочные продукты — толуол и углекислый газ.
Удаление защиты можно проводить без специального оборудования и навыков, обычно с количественным выходом. Это самый изящный метод.
Удаление группы Z стимулировало дальнейшие исследования в области кислоточувствительных защитных групп, что привело к разработке ряда блокирующих групп, удаляемых в мягких условиях.
Наиболее важными были, например, трет-бутилоксикарбонильная (Boc), O-нитрофенилсульфенильная (Nps) и бифенилизопропилоксикарбонильная (Bpoc) группы. Удаление защиты с помощью нуклеофилов представляется привлекательной альтернативой кислотолизу в случае группы Nps. Отщепление группы 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc) вторичными аминами приобрело значительное значение в синтезе сложных пептидов.
Однако сшивание через ангидриды стало популярным среди пептидных химиков. Из-за разнообразия компонентов, используемых для активации защищённых аминокислот, смешанные или несимметричные ангидриды были предложены многими исследователями как различные варианты общего подхода к формированию пептидной связи.
Выход и чистота пептидов могут быть достигнуты с использованием изопропил-, изобутил- или сек-бутилкарбоновых ангидридов.
Некоторые эфиры стали очень популярными, например, эфиры нитрофенола, 2,4,5-трихлорфенола, N-гидроксисукцинимида и пентафторфенола.
«Реагенты сшивания» используются в пептидном синтезе как эффективный метод образования пептидной связи. Это соединения, которые могут быть добавлены в реакционную смесь частично защищённой аминокислоты или пептида со свободной карбоксильной группой и второй защищённой аминокислоты или пептида со свободной аминогруппой. Наиболее успешный реагент сшивания — дициклогексилкарбодиимид (DCC или DCCI) — был предложен Шиэном и Хессом в 1955 году. DCC, его водорастворимые производные (EDCI; 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) и диизопропилкарбодиимид остаются ведущими реагентами сшивания до настоящего времени.
Соединения, образующие смешанные ангидриды — 1-этоксикарбонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолин (EEDQ) и его аналог 1-изобутоксикарбонил-2-изобутокси-1,2-дигидрохинолин (IIDQ) — являются полезными реагентами сшивания. Они легко подготавливаются, хорошо хранятся и вызывают минимальную рацемизацию или побочные реакции.
Большинство пептидных синтезов сопровождаются незначительными нежелательными побочными реакциями, и пептиды могут быть загрязнены побочными продуктами. Существует решение, позволяющее избежать образования побочных продуктов.
Синтез пептидов на твёрдой фазе
Синтез пептидов гораздо более сложный процесс, чем простое образование амидных связей при смешивании необходимых аминокислот в реакционном сосуде. Двадцать природных и бесчисленное множество неприродных аминокислот дают огромное число возможных комбинаций при использовании этого метода.
В растворе, где смешаны две аминокислоты, образуются четыре различных дипептида, а также другие более длинные пептиды; например, в смеси глицина и аланина образуются четыре дипептида: Gly-Gly, Gly-Ala, Ala-Gly и Ala-Ala.
Твердофазный синтез пептидов был разработан с целью обеспечения быстрого, упрощенного и эффективного метода получения пептидов и небольших белков (Меррифилд, 1963).
Чтобы гарантировать образование желаемого пептида, основная группа одной аминокислоты и кислотная группа другой должны быть лишены возможности вступать в реакцию. Такая «деактивация» называется защитой реакционноспособных групп. Группа, неспособная вступать в реакцию, называется защитной группой.
В классическом органическом синтезе кислотные группы защищают, дают им прореагировать, а затем защиту снимают. После этого один конец пептида защищают и дают ему прореагировать с новой защищенной кислотой, и так далее. В твердофазном синтезе пептидов (SPPS) один конец пептида прикрепляется к нерастворимому полимеру и остается защищенным на протяжении всего синтеза пептида, что означает меньшее количество этапов и упрощенную очистку, поскольку реагенты можно смыть, не потеряв пептид.
Твердофазный синтез пептидов включает следующие этапы: присоединение аминокислоты к полимеру, защита, конденсация, снятие защиты и удаление полимера.
Присоединение аминокислоты к полимеру
Присоединение осуществляется путем реакции аминокислоты с связывающим агентом, а затем — реакцией другого конца связующего агента с полимером. Образуется связь между пептидом и полиамидом, которая не будет гидролизоваться в ходе последующих реакций синтеза пептида. Распространенные связывающие агенты — это ди- и тризамещённые бензолы, как показано ниже.
Эти компоненты вместе с C-концевой аминокислотой и смолой образуют следующую полимерную структуру.
Защита
Следующая аминокислота должна иметь защищённую аминогруппу, чтобы предотвратить нежелательную реакцию кислот между собой. В качестве отличной защитной группы используется FMOC (9-флуоренилметоксикарбонил). Кроме того, любые боковые цепи аминокислот, содержащие ароматические, кислотные, основные и/или полярные группы, могут быть реакционноспособны. Их необходимо защитить, чтобы не образовывались нежелательные разветвленные цепи. Наиболее часто применяются четыре типа защитных групп: трет-бутильная (tBu), трифенилметильная (Trt), трет-бутилоксикарбонильная (tBOC) и 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонильная (PMC).
Конденсация
Защищённая FMOC аминокислота реагирует с последней аминокислотой, присоединённой к полиамиду. Реакция катализируется DCC (N,N'-дициклогексилкарбодиимидом).
Снятие защиты
Избыток DCC удаляется промывкой водой. Группа FMOC удаляется пиперидином (вторичным циклическим амином). Защитная группа на кислоте удаляется с цепи, и можно присоединять следующую кислотную молекулу. На втором этапе новая аминокислота снова защищается. Этот циклический процесс продолжается до достижения требуемой длины цепи.
Удаление полимера
После завершения синтеза нужного пептида его необходимо отделить от полиамида. Это достигается обработкой 95% раствором трифторуксусной кислоты (TFA). На этом этапе также удаляются боковые защитные группы.
Преимущества и недостатки твердофазного синтеза пептидов (SPPS)
Основным преимуществом SPPS является высокий выход пептида. Так как пептид состоит из множества аминокислот, а выход каждой реакции ниже 100%, общий выход традиционного синтеза крайне мал. Например, при выходе каждой аминокислоты в 90%, общий выход пептида из 100 аминокислот составит всего лишь 0,003%.
Твердофазный синтез пептидов гораздо быстрее классического синтеза в растворе. SPPS позволяет получить пептид из 20 аминокислот за 24 часа, а более длинные цепи — менее чем за неделю.
С развитием современных автоматизированных синтезаторов, а также усовершенствованием аналитического и очистительного оборудования, химик может синтезировать пептиды длиной от 20 до 50 аминокислот в количестве от 20 до 100 миллиграммов.
Ключевым преимуществом SPPS является эффективность отделения промежуточных соединений от исходных веществ, реагентов и большинства побочных продуктов. Пептид, связанный с нерастворимым полимером, остаётся нерастворённым в процессе обработки растворителями.
Ещё одно преимущество SPPS — отсутствие необходимости во времязатратной изоляции промежуточных продуктов путём экстракции или кристаллизации. Проблема подбора растворителей для высокомолекулярных соединений исчезает, так как достаточно использовать растворители, в которых полимер просто набухает.
Становится довольно просто превратить соль аминокислоты в свободный амин путём обработки пептидной смолы третичным основанием и последующего удаления образовавшейся алкиламмониевой соли промывкой.
Главный недостаток SPPS — невозможность очистки промежуточных соединений и ограниченные возможности их характеристики.
Тем не менее, описано множество устройств для автоматического проведения SPPS, а также разработаны методы для непрерывного аналитического контроля построения пептида.
Ссылки
1. M. Bodanszky. Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed., Springer, Heidelberg, 1993. [Book].
2. Bernd Gutte. Peptides: Synthesis, Structures, and Applications. Academic Press; 1 edition (November 2, 1995). [Book].
3. Gregg B. Fields. Introduction to Peptide Synthesis. Current Protocols in Protein Science. [Article].
4. T. Wieland, M. Bodanszky. The World of Peptides. A Brief History of Peptide Chemistry. [Book].
5. Fields GB, Noble RL. Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids. Int J Pept Protein Res. 1990; 35:161–214. [Article].
6. Merrifield B. Solid phase synthesis. Science. 1986; 232:341–347. [Article].