Очищение полипептидов

Полипептиды представляют собой сложную задачу для изоляции¹ из-за их широкого разнообразия аминокислотных последовательностей, посттрансляционных модификаций (ацетилирование, метилирование, фосфорилирование, гликозилирование и т. д.) или конформационных различий (если используемый механизм разделения не включает денатурирующих условий). Необходимо учитывать источник материала (синтетический или биологический), а также возможные ограничения, связанные с последующими этапами анализа или производства. Методы очистки включают обращённо-фазовую хроматографию (RPC), ионообменную хроматографию (IEX), гидрофильное взаимодействие^2,3 (HILIC), электростатическое гидрофильное взаимодействие⁴ (ERLIC), также известное как ионно-парная нормальная фаза⁵, гидрофобное взаимодействие (HIC) и разделение по размеру (SEC).

Аналитические методы разделения выигрывают от подходов, которые снижают сложность анализа чистоты или состава изолята. Осаждение, экстракция растворителями, аффинная изоляция — всё это повышает концентрацию целевого полипептида и снижает нагрузку на хроматографическую колонку. Основной механизм разделения усиливает различия между молекулами, поэтому подход «один метод для всех задач» ограничивает возможности, заставляя полагаться на «теоретические тарелки» (N) колонки вместо более мощной «химической селективности» (α, альфа) для получения или оценки чистого компонента. Третья переменная в уравнении разрешения — «фактор удерживания» или коэффициент удерживания⁶ (k') — это мера удерживания пика, независимая от геометрии колонки или скорости потока подвижной фазы. Его эффективность снижается по мере приближения к десяти мёртвым объёмам колонки (в изократическом режиме), и хотя это не совсем корректное утверждение, оно отражает изменение наклона градиентного разделения, если описывать его через время удерживания компонента.

Таким образом, хроматография сложных образцов наиболее эффективна при использовании ортогональных химических подходов, основанных на принципиально различных механизмах. Применение двух одинаковых методов (например, RPC-C4 : RPC-C18; низкий pH RPC : высокий pH RPC; HIC : RPC) менее эффективно для усиления различий между смесями аналитических соединений, чем использование действительно ортогональных техник (например, IEX : RPC; HILIC : RPC; NP : RPC). Первая стадия упрощает смесь, чтобы на второй (или третьей) стадии было меньше конкурирующих аналитических компонентов. Так, смесь пентапептидов — позиционных изомеров из 4 пролинов и одной серина — может быть трудно разделить только методом RPC, но HILIC позволит различить полярность в зависимости от положения серина в молекуле. Аналогично, продукты дезамидирования образуют позиционные изомеры — аспарагиновую кислоту и изо-аспарагиновую кислоту, которые гидрофобно схожи, но значительно отличаются по полярности. Таким образом, хотя изоляция с помощью RPC затруднена, смесь, полученная методом RPC, может быть разделена на индивидуальные компоненты с помощью ERLIC⁷.

Максимального разрешения можно добиться с помощью ортогонального подхода, вместо попыток провести всё разделение на одной колонке, независимо от эффективности среды (например, суб-2 микронная UHPLC или пористая SPP). Компоненты, элюирующие близко друг к другу, обладают схожими механизмами взаимодействия, но могут значительно различаться по заряду или другим функциональным группам. Ортогональная химия позволяет воспользоваться этим различием. Неважно, идёт ли речь о компонентах с одинаковым зарядом, но разной последовательностью, или о схожей гидрофобности при различной полярности — оба случая ограничены одним химическим методом. Второй химический подход к разделению повышает вероятность успешного анализа или изоляции (в препаративном масштабе).

Градиентное элюирование предпочтительно для разделения полипептидов

Поскольку крупные полипептиды диффундируют медленно, при RPC формируются более широкие пики, чем при анализе малых молекул. Градиентное элюирование является предпочтительным подходом для сокращения времени анализа. Градиенты — это по сути сжатые изократические режимы. Если бы насос подавал неограниченное количество растворителя, все компоненты со временем бы элюировали. Поэтому при таких приложениях, как захват (trapping) или твердофазная экстракция, лучше ограничить количество мёртвых объёмов колонки, чтобы избежать непредсказуемого выхода слабоудерживаемых веществ. Идеальный объём загрузки/захвата — это один объём сорбента меньше, чем k’ (объём элюирования минус мёртвый объём) первого пика интереса. Если проводится количественная протеомика с целью обнаружения и количественной оценки всех полипептидов, необходимо соблюдать этот объёмный предел. Наиболее безопасным считается объём, равный одному хроматографическому объёму сорбента, но из-за ограничений по чувствительности при анализе малокопийных пептидов это компромисс. Решение — выбрать условия хроматографии, увеличивающие удерживание компонентов, или изменить химию колонки для достижения более длительного удерживания.

Сорбенты на основе модифицированного кремнезёма имеют плотность около 50%, поэтому легко оценить хроматографический мёртвый объём. Он примерно равен микролитрам на миллиграмм сорбента. Поскольку объём сорбента примерно вдвое превышает массу (в мкл), можно по объёму трубки пересчитать как массу, так и мёртвый объём колонки (часто называемый «объёмом колонки», не путать с объёмом трубки).

Ширина пиков полипептидов при изократическом элюировании зависит от молекулярной массы. Например, трипептид даст пик, соответствующий 600 теоретическим тарелкам, независимо от того, насколько эффективна колонка при тестировании малыми молекулами. Градиентное элюирование полипептидов, даже при пологих градиентах, предпочтительно, поскольку приводит к гораздо более узким пикам по сравнению с изократическим элюированием. HPLC-сорбенты представляют собой пористые частицы с привитым лигандом на поверхности кремнезёма. Гидрофобная фаза обычно образована линейным алифатическим углеводородом с числом углеродов C18, C8 или C4. Длина цепи углеводорода зачастую мало влияет на эффективность разделения белков, но влияет на выход (восстановление). Чтобы полипептиды разделялись, они должны проникать в поры и распределяться между подвижной и неподвижной фазами. Полипептиды плохо разделяются в RPC, отчасти потому что многие из них слишком большие, чтобы полностью войти в поры, что приводит к смешанному механизму — разделению по размеру и гидрофобному взаимодействию, что выражается в расширении полос (пиков), поскольку молекулы диффундируют с разной скоростью на разную глубину. Большинство RPC-разделений полипептидов проводится на колонках с порами около 300 Å, хотя пептиды с молекулярной массой менее ~2000 Да можно разделять и на сорбентах с порами 120 Å, а очень крупные полипептиды (например, фрагменты антител) — на колонках с порами 1000 Å. В ионообменной хроматографии в водной фазе диффузия происходит медленнее, поэтому используются сорбенты с порами 1000 Å и больше, либо частично пористые среды, чтобы сократить путь диффузии и повысить разрешение.

Подходы адсорбции/десорбции для гидрофобных фаз

Пептиды десорбируются с гидрофобных поверхностей в очень узком диапазоне концентраций органического модификатора, поскольку для десорбции требуется строго определённое количество молекул модификатора, соответствующее конформационной структуре полипептида⁸. Эта особенность объясняет гидрофобную селективность очень схожих пептидов при разделении методом RP-HPLC и формирование очень острых хроматографических пиков. RPC остаётся самым простым методом для разделения пептидов, используя комбинацию воды и ацетонитрила (ACN) с ионообразующим агентом, таким как трифторуксусная кислота (TFA), гексафтормасляная кислота (HFBA) или летучие/нелетучие буферные соли — в зависимости от применяемой методики и используемого оборудования.

Шаги адсорбции/десорбции происходят в тот момент, когда полипептид удерживается на колонке. После десорбции происходит минимальное взаимодействие между полипептидом и поверхностью обращённой фазы, и последующие взаимодействия практически не влияют на разделение. Таким образом, увеличение длины колонки даёт преимущество в виде большей загрузки, но даёт лишь незначительный прирост в разрешении после того, как пептиды начинают элюироваться. Размер частиц и доступность пор имеют наибольшее влияние на эффективность разделения при данной химии поверхности. Чувствительность удерживания полипептидов к незначительным изменениям концентрации модификатора делает изократическое элюирование затруднительным, поскольку концентрацию модификатора в микроокружении пептида нужно изменять крайне точно для равномерной десорбции.

Для более крупных полипептидов, где необходимо сохранить нативную конформацию, предпочтительно использовать гидрофобное взаимодействие (HIC) как гидрофобный метод. Здесь также применяется гидрофобная поверхность, но с плотностью лиганда примерно в 10 раз ниже, чем у колонок RPC. Кроме того, необходимы частицы с меньшей площадью поверхности (то есть с большими порами), чтобы вместить крупные молекулы полипептидов, поскольку они диффундируют ещё медленнее, чем малые пептиды, и близкое расположение поверхности снижает расширение пика, вызванное смешанным механизмом SEC – HIC. Однако вместо использования органического растворителя для растворения и адсорбции/десорбции белка применяется обратный солевой градиент. Этот подход является хроматографическим эквивалентом осаждения белков с помощью соли и основан на удалении воды из белка, что вызывает его агрегацию и выпадение в осадок из водного раствора. Этот процесс протекает медленнее, чем десорбция в RPC, поэтому пики на хроматограмме получаются более широкими по мере удаления соли и повторного растворения белка.

Поскольку HIC использует солевые градиенты, его не следует применять перед ионообменным разделением (IEX), так как соль способствует элюированию в IEX. Хотя оба метода являются высокоемкими техниками изоляции, использующими градиенты соли или pH, более эффективной последовательностью будет сначала применить IEX, затем HIC (и при необходимости диализ для удаления соли перед следующими этапами).

Различия в селективности в HIC возможны в пределах ряда Гофмейстера для хаотропных солей^9,10. Разные соли обладают специфическим ионным эффектом, влияющим на их способность гидратировать поверхности и избирательно удерживать (осаждать) смесь белков на гидрофобной поверхности. Сульфат аммония — наименее селективный, но наиболее часто используемый. Лучше пошагово увеличивать количество соли и тестировать её влияние, поскольку разные белки осаждаются при разных концентрациях соли. Поскольку скорость повторного растворения (гидратации) низкая, можно добиться разделения, которое могло бы быть утеряно, если бы скорость гидратации оказалась определяющим фактором, а не начальная разница в растворимости.

Влияние диаметра и длины колонки на чувствительность детекции

Диаметр и длина колонки не влияют на разрешающую способность пиков, но влияют на загрузку образца, расход растворителя и при определённых условиях — на чувствительность детектирования. Скорость потока и загрузка пропорциональны квадрату отношения диаметров колонок. Загрузка также пропорциональна отношению длин колонок при переходе от одной длины к другой. Таким образом, уменьшение диаметра снижает расход растворителя и может повысить чувствительность, если объём/масса инжекции остаются неизменными. Ошибочно считать, что меньший внутренний диаметр сам по себе увеличит чувствительность — всё зависит от пропорций. Однако очень узкие колонки полезны при сопряжении ВЭЖХ с масс-спектрометрией (LC-MS), где эффективность удаления растворителя зависит от конструкции масс-спектрометра. Триптические гидролизаты с содержанием белка всего 5 наномолей успешно разделялись и собирались с использованием RP-HPLC колонок диаметром 2.1 мм с УФ-детекцией. Чувствительность MS выше благодаря универсальному и разрушающему механизму детектирования. Детекция LC-MS с использованием более летучих растворителей, как в случае HILIC или ERLIC (ионно-парная нормальная фаза), может быть в 100 раз чувствительнее, чем LC-MS на основе RPC.

Подвижные фазы и влияние температуры

Полипептиды обычно лучше растворимы в водных растворителях, чем при высоких концентрациях органики. Повышение температуры способствует диффузии, снижая вязкость растворителя и увеличивая растворимость в водно-органических смесях, что приводит к более узким и ранним пикам. Однако модифицированные фазы на основе кремнезёма имеют ограничение по температуре, связанное с прочностью ковалентной связи. Поэтому 40°C является стандартной температурой, а 60°C — уже приближается к пределу прочности связи кремнезём-силан.

Десорбция с RPC-колонок усиливается при добавлении в водные растворители органического модификатора и ионообменного реагента или буфера. Элюирование происходит при постепенном достижении концентрации органического растворителя, необходимой для десорбции. Органический модификатор растворяет и десорбирует полипептиды с гидрофобной поверхности, а ионно-парный реагент или буфер контролирует как полярность химии колонки, так и самого полипептида. Он задаёт pH элюента и образует ионную пару с цвиттерионными полипептидами, удерживая их в единой ионной и гидрофобной форме.

Трифторуксусная кислота (TFA) — наиболее часто используемый ионно-парный реагент для RPC с УФ-детекцией. Она широко применяется благодаря слабому поглощению в УФ-области на малых длинах волн и летучести, что облегчает удаление из собранных фракций. TFA обычно используется в концентрации около 0.1% (м/об.). Однако при градиенте с постоянной концентрацией TFA может наблюдаться сдвиг базовой линии при мониторинге на 210–220 нм, вызванный изменением диэлектрической проницаемости. По мере перехода растворителя от водной к неводной фазе (с содержанием ацетонитрила, ACN), это влияет на π-π электронные взаимодействия, что в свою очередь влияет на УФ-поглощение растворителя (в диапазоне 190–250 нм). Чтобы уменьшить или устранить такой дрейф, рекомендуется использовать 0.1% TFA в растворителе A и 0.085% TFA в растворителе B — это уравновешивает взаимодействия. Важно использовать качественную TFA и приобретать её в маленьких ампулах. Некачественная или старая TFA содержит примеси, поглощающие в УФ, вызывая ложные пики. Она не рекомендуется для LC-MS, так как снижает чувствительность из-за усиленных «матричных эффектов». Вместо неё рекомендуется использовать муравьиную кислоту или, предпочтительно, буфер формиата аммония для контроля ионных форм аналита и pH элюента.

Гептафтормасляная кислота (HFBA) при обращённо-фазовой хроматографии в концентрациях до 0.1% об. значительно лучше удерживает пептиды, содержащие основные аминокислоты, чем TFA, муравьиная или уксусная кислоты. Однако в LC-MS она вызывает значительное подавление сигнала, поэтому для обоих ионно-парных реагентов предпочтительнее использовать УФ-детекцию. В отличие от TFA, для HFBA используют немного более высокую концентрацию в Буфере B (Буфер A: 0.54%, Буфер B: 0.60%), чтобы выровнять базовую линию для УФ-детектора.

Органические кислоты способствуют ионизации основных соединений за счёт протонирования C-концевого остатка и боковых цепей аспарагиновой и глутаминовой кислот, что усиливает детекцию положительных ионов в масс-спектрометрии. Для предотвращения фоновых матричных эффектов, подавления сигнала и загрязнения ионного источника MS необходимы летучие буферы и ионно-парные реагенты. Предпочтительно использовать буферы, а не свободные кислоты, так как они регулируют ионизацию и способствуют формированию узких пиков, особенно при разделении методом HILIC. К ним относятся: формиат или ацетат аммония (оптимум 2–10 мМ; при концентрации на колонке свыше 20 мМ возможны эффекты подавления); уксусная кислота в концентрации 0.1–1.0% об.; муравьиная кислота (FA) — 0.1–0.5% об.

Ацетонитрил (ACN) — наиболее часто используемый органический растворитель, так как он летучий и легко удаляется из собранных фракций. Он обладает низкой вязкостью, что снижает противодавление в колонке, слабо поглощает в УФ-области на коротких длинах волн и широко доступен. Изопропанол часто используется для крупных или очень гидрофобных белков. Его главный недостаток — высокая вязкость и порог поглощения в УФ при 230 нм. Добавление 1–3% изопропанола в ацетонитрил может повысить выход белка, как и использование колонки с более короткой алкильной цепью, например, C4. Этанол часто применяется в промышленных масштабах как по финансовым, так и по нормативным соображениям.

Подвижные фазы для разделения HILIC и ERLIC начинаются с высоких концентраций апротонных, смешивающихся с водой растворителей и вызывают десорбцию полипептидов либо за счёт увеличения силы буфера, либо за счёт снижения доли органического компонента. Полипептиды элюируются на основе различий в полярности и заряде^2,3,4,5 с полярных поверхностей колонок — от открытого кремнезёма до модифицированных химий (например, диол, ионообменные фазы, подходящие для подвижных фаз с высоким содержанием органики), а также всё более разнообразных цвиттерионных фаз, использующих кулоновские взаимодействия ионных и нейтральных полярных групп в смесях полипептидов.

Влияние pH на разделение пептидов

Разделение пептидов часто чувствительно к pH элюента из-за протонирования или депротонирования кислотных или основных боковых цепей. В целом, разделение при слабокислом pH (6.0 или 6.5) с использованием ацетата триэтиламина (TEAA) или фосфатного буфера демонстрирует лучшую форму пиков и разрешение, или, по крайней мере, большее число разделённых компонентов, по сравнению с разделением при сильно кислых pH с TFA, TEAP или фосфатом. Это наблюдение важно, учитывая тот факт, что условия сильной кислотности, такие как 0.1% TFA, являются стандартом для обращённо-фазовой хроматографии пептидов. Полученные здесь результаты указывают, что разделение при pH 6.0 или 6.5 более эффективно для труднодоразделимых компонентов. Однако следует отметить, что эти выводы специфичны для данного пептидного образца. Они могут не распространяться на другие образцы. Серия пробных разделений может помочь подобрать оптимальные условия для конкретной задачи очистки пептида.

Разрешение можно изменить, используя другой ионно-парный реагент или более высокий pH. TFA является лучшей отправной точкой для разделения пептидов. Однако стоит рассмотреть буферы, такие как фосфатный или соляная кислота при низком или щелочном pH. Подготовьте растворы подвижной фазы концентрацией 10–20 мМ с pH 4.4, pH 2.0 и pH 6.5 на основе фосфата. Сравните их с 0.1% TFA, 0.1% HCl и 10 мМ буфером pH 10.0 (на полимерной или устойчивой к pH колонке), чтобы найти оптимальный реагент и pH-условия для качественного разделения пептидов.

Фрагменты пептидов после переваривания белков: Дезамидирование и окисление

Дезамидирование белка приводит к превращению нейтрального аспарагина в кислоту — аспарагиновую или её позиционный изомер изо-аспарагиновую кислоту, что увеличивает полярность белка. При нейтральном pH белок становится более гидрофильным. Соответственно, использование ERLIC⁸ или HILIC позволит лучше различать эти три формы пептидов, чем метод RPC.

Фрагменты пептидов после переваривания белков: Гликопептиды

Анализ триптического гидролизата методом LC-MS даёт информацию о структуре белка. Однако гликопептиды будут коэлюироваться с негликозилированными пептидами при RPC, если предварительная фракционирование не упростило смесь. Простой метод⁵ обогащения гликопептидов использует условия ионно-парной нормальной фазы (HILIC). Добавляя TFA в образец и подвижную фазу, происходит протонирование карбоксильных групп и образование ионных пар с аминами всех пептидов в гидролизате, оставляя только гликоформы как наиболее полярные пептиды в смеси. Последующее разделение методом HILIC в HPLC или SPE даёт обогащённую выборку только гликозилированных форм, которые затем можно охарактеризовать LC-MS при условиях RPC или HILIC, либо провести дегликозилирование и анализировать методами IEX-HILIC-LC-MS.

Ссылки и ресурсы

1. A Practical Guide to Peptide and Protein Purification for Microsequencing, 2nd Edition, Paul T. Matsudiara (editor), Academic Press, Inc. (1993).
2. Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds, Andrew J. Alpert, J. Chromatogr. 499 (1990) 177.
3. Review: Hydrophilic-interaction chromatography, Petrus Hemstrm and Knut Irgum, J. Sep. Sci. 2006, 29, 1784 – 1821.
4. Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides, Andrew J. Alpert, Anal. Chem. 2008, 80, 62-76.
5. Identification and Quantification of Glycoproteins Using Ion-Pairing Normal-phase Liquid Chromatography and Mass Spectrometry, Wen Ding, et al., Mol Cell Proteomics 2009 8: 2170-2185. First Published on June 12, 2009.
6. Chromatographic formulas and principles: http://www.lcresources.com/resources/TSWiz/hs210.htm.
7. Enhanced Separation and Characterization of Deamidated Peptides with RP-ERLIC-Based Multidimensional Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry, Hao, et al. | J. Proteome Res. 2012, 11, 1804−1811
8. Retention Model for Proteins in Reversed-Phase Liquid Chromatography, X. Geng and F.E. Regnier, J. Chrom. 296, 15-30 (1984)
9. Interactions between macromolecules and ions: the Hofmeister series, Yanjie Zhang and Paul S Cremer, Current Opinion in Chemical Biology, Volume 10, Issue 6, December 2006, Pages 658–663.
10. The Hofmeister effect and the behaviour of water at interfaces, Collins KD, Washabaugh MW, Q Rev Biophys. 1985 Nov;18(4):323-422.

Страница последний раз обновлена: 13.06.2025.