Библиотека пептидов

Мощные пептиды ведут к множеству открытий. Разработка новых методов скрининга и синтеза пептидов может привести к эффективным и экономичным подходам, делающим лекарства более действенными, болезни — легче излечимыми, а жизнь — более продолжительной.

Аминокислоты соединяются между собой с помощью нескольких ковалентных связей, называемых пептидными связями, чтобы образовать белки. Пептидная связь формируется между аминогруппой одной аминокислоты и карбоксильной группой другой. Кроме того, библиотека пептидов является инструментом для изучения белков. Также гексапептид — это пептид, содержащий шесть аминокислотных остатков.

Что означает «mer» в контексте библиотеки пептидов?

Термин «mer» обозначает количество остатков в пептиде. Например, пептид, состоящий из 21 аминокислотного остатка, может называться либо декапептидом, либо 21-mer пептидом. Важно отметить, что «mer» не указывает на молекулярную массу (Mr или MW) пептида. Такая номенклатура также применяется и к другим полимерам, где она указывает на число остатков в молекуле.

Библиотеки пептидов: практическое решение

Библиотека пептидов содержит большое количество пептидов с систематической комбинацией аминокислот. Обычно библиотека пептидов синтезируется на твёрдой фазе, чаще всего на смоле, которая может быть как плоской поверхностью, так и шариками.

Библиотека пептидов является мощным инструментом для:
• Разработки и проектирования лекарств
• Изучения белок-белковых взаимодействий
• Других биохимических и фармацевтических приложений

Путём производства большого числа пептидов, каждый из которых отличается от другого всего одной аминокислотой, можно определить, какие замены аминокислот усиливают связывание с рецептором, а какие — ослабляют. Основная задача — как удобно и экономически эффективно синтезировать тысячи или даже миллионы пептидов для последующего использования в исследованиях связывания. Одним из решений является их синтез или комбинирование.

В каждой позиции последовательности можно создать смесь из нужных аминокислот. Таким образом, можно разработать библиотеку из 20 различных полипептидов, отличающихся только одной случайной аминокислотой, при этом все остальные позиции остаются неизменными. Существует, однако, ограничение — учёные не могут создавать пептиды длиной более 70 аминокислот.

Тем не менее, поскольку существует 20 натуральных аминокислот, линейный пептид длиной n аминокислот может быть представлен в 20n различных комбинациях. Это означает, что можно создать 64 000 000 различных гексапептидов. Таким образом, библиотеки пептидов являются чрезвычайно мощными инструментами в биологических и фармацевтических исследованиях. В них скринируются огромные количества пептидов для выделения и идентификации критически важных биологически активных молекул, применяемых для новых подходов к лечению болезней и рака.

Эти инструменты помогают:
• Направлять учёных по этапам, позволяющим выделить минимальную длину активной пептидной последовательности
- Это помогает ученым воспроизводить или копировать пептидные последовательности для исследовательских целей
• Определять критические аминокислотные остатки
- Это объясняет, из чего состоят пептиды
• Разрабатывать аналоги для оптимизации последовательностей
- Это помогает выявить наиболее важные элементы в последовательности, позволяя избежать использования длинных пептидных цепей.

Библиотеки «один шарик — одно соединение» (OBOC)

Методы синтеза для создания библиотек пептидов типа «один шарик — одно соединение» (OBOC) показали преимущество по сравнению со стандартными форматами анализов и стратегиями смешивания. Формат OBOC применим для анализов вне смолы (off-bead). В таком анализе пептид высвобождается с шарика смолы, но остаётся в его непосредственной близости. Помещение библиотеки и тестируемой клеточной линии в мягкую агаровую среду с последующим частичным высвобождением пептидов приводит к высокому их содержанию вокруг каждого шарика. Пептиды с нужной активностью выявляются по зонам с уменьшенным ростом клеток или по другим признакам, таким как изменение цвета. Эти шарики затем изолируют и анализируют.

Этот метод позволяет идентифицировать пептидные лиганды и цитотоксические пептиды, которые могут быть полезны в разработке противораковых средств. Уникальная техника скрининга, описанная выше, сочетает химию пептидов с форматом библиотеки OBOC.

К другим уникальным методам скрининга в химии пептидов относятся:
• Прямая визуализация связывания раковых клеток с пептидами на шариках
• Сортировка клеток с помощью флуоресцентного активатора (FACS)

Библиотеки OBOC являются мощными инструментами, используемыми для поиска богатых цистеином пептидов для мечения белков, разработки цистеин-содержащих фармпрепаратов и не только. Технология OBOC используется для воспроизводства библиотек, и этот подход доказал свою высокую эффективность. Это позволяет учёным использовать простые методы скрининга, при которых на каждом шарике размещается лишь одна последовательность. Такие методы, как групповые (пуловые) технологии секвенирования, вскоре могут уйти в прошлое.

Сами по себе библиотеки могут быть более однородными по сравнению с другими методами при выявлении полноразмерных лигандов во время скрининга, поскольку вырождение по молекулярной массе может быть устранено уже на этапе секвенирования, а не во время синтеза, что делает всю технологию более простой и дешёвой.

Комбинаторные пептидные библиотеки и лиганды: более эффективные подходы

Лигандами называют «доноры электронов», которые притягиваются к акцептору электронов в центре комплекса — ион или молекула связывается с центральным атомом металла и образует комплекс. Лиганды, которые могут быть как отрицательно заряженными, так и нейтральными, предоставляют оба электрона для образования связи с центральным атомом или ионом металла.

Новые методы, направленные на выявление аффинных лигандов к гликозилированному гемоглобину (HbA1c), играют важную роль в контроле сахарного диабета. Этот относительно новый подход к использованию лигандов особенно эффективен для крупномасштабного синтеза. Преимущества использования лигандов вместо антител заключаются в следующем:
• Антитела значительно дороже в производстве
• Антитела нестабильны
• Лиганды столь же эффективны, как и антитела, поскольку они связываются с анализируемым веществом аналогичным образом.

Комбинаторные синтетические пептидные библиотеки и антимикробные пептиды (AMP)

Хоутен и соавт., как сообщается в работе «Generation and use of synthetic peptide combinatorial libraries for basic research and drug discovery», смогли обойти ограничения, присущие более популярным методам синтеза и скрининга большого числа пептидов. Типичными трудностями существующих подходов являются неспособность синтезировать и протестировать необходимое количество пептидов (в миллионах), а также невозможность создавать немодифицированные пептиды в достаточном количестве, которые сохраняют активность в растворе. Хоутен и его коллеги разработали новые антимикробные пептиды.

Антимикробные пептиды (AMP) — это уникальные и многофункциональные короткие пептиды, содержащие менее 100 аминокислотных остатков. Они имеют суммарный положительный заряд от +2 до +9. Их структура включает положительно заряженные аминокислоты (например, лизин и аргинин), а также значительное количество гидрофобных остатков. Структурные и физико-химические характеристики AMP напрямую связаны с их способностью избирательно воздействовать на клетки-мишени.

AMP действуют как многогранные эффекторные молекулы. Антимикробные пептиды включают необычные и ценные аминокислоты, каждая из которых придаёт соединению специфический механизм действия. Некоторые из их выдающихся функций включают:
• Сигнальные молекулы
• Модуляторы иммунного ответа
• Митогены (стимулирующие деление клеток)
• Противоопухолевые агенты
• Контрацептивные средства

AMP (антимикробные пептиды) активно исследуются как потенциальные системы доставки лекарств, способные проникать в клетки, которые обычно непроницаемы, обеспечивая доставку жизненно важных препаратов прямо внутрь клетки.

Светлое будущее пептидов

Комбинаторные пептидные библиотеки в сочетании с компьютерным моделированием открывают новые горизонты в применении биологически активных пептидов для лечения заболеваний и рака, а также повышения эффективности лекарственных препаратов. Будущее AMP-исследований и даже клинических испытаний выглядит многообещающим, особенно с учётом внимания к их структурным и биологическим свойствам, а также профилактическим и терапевтическим возможностям. Пептиды стремительно изменяют облик научных открытий, химии, биохимии, фармацевтики и современной медицины.

Ссылки
1. Houghten RA, Pinilla C, Blondelle SE, Appel JR, Dooley CT, Cuervo JH. Generation and use of synthetic peptide combinatorial libraries for basic research and drug discovery. Nature 354, 84-86 (07 November 1991). [PubMed].
2. Liu, R. and Lam, K. S. Peptide Combinatorial Libraries. Wiley Encyclopedia of Chemical Biology. 2008, 1-13. [Article].
3. B. Chen et al. The synthesis and screening of a combinatorial peptide library for affinity ligands for glycosylated haemoglobin. Biosensors & Bioelectronics 13 (1998) 779-785. [PubMed].
4. Wah Y. Wong, Hasmukh B. Sheth, Arne Holm, Robert S. Hodges, Randall T. Irvin. Representative Combinatorial Peptide Libraries: An Approach to Reduce both Synthesis and Screening Efforts. A Companion to Methods in Enzymology 6, 404-410 (1994). [Article].